近日，我校生命科学学院、亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室和岭南现代农业科学与技术广东省实验室刘耀光院士/祝钦泷研究员团队在国际知名学术期刊Plant Biotechnology Journal（IF2021=13.263，生物学/工程技术1区）在线发表了题为“Efficient assembly of long DNA fragments and multiple genes with improved nickase-based cloning and Cre/loxP recombination”的研究论文（论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13882），利用特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的DNA组装与Cre/loxP重组相结合，开发了一种新的简单、高效、低成本的大片段DNA克隆与多基因叠加系统TGSII-UNiE。
功能基因组学、合成生物学、分子农场的应用、复杂性状的遗传改良以及代谢工程操作等，都涉及到DNA大片段（LDNA）的克隆和多基因的组装。尽管目前已有多种DNA组装技术，如Golden Gate克隆、重组酶系统、Gibson组装等，但仍然存在操作复杂、耗时费力且价格昂贵的问题。因此，开发一种简单、高效、低成本的DNA组装方法十分必要。缺刻酶（Nicking endonuclease，NiE）是一类能在DNA单链特定识别序列产生缺刻的限制性内切酶。当其被设计到DNA片段末端时，经过酶切和变性时，就能产生单链突出末端，已被用于缺刻酶介导的不依赖连接酶克隆（NiE-mediated ligation-independent cloning，NiE-LIC）。NiE-LIC具有操作简单和成本低的优点，但是由于其创制的单链突出末端较短（小于10个碱基（nt）），多片段组装效率低。为此，该研究通过序列优化设计得到了一系列15 nt的特异核苷酸序列（Unique nucleotide sequences，UNSs），并使用热稳定的Taq DNA 连接酶和采用变温连接（thermo-cycle ligation），开发了更高效的特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的DNA组装（UNS-guided NiE-mediated DNA assembly，UNiEDA）。进一步将UNiEDA引入到作者之前开发的Cre/loxP介导的多基因叠加系统TGSII（TransGene Stacking II）中，开发了一种新的简单、高效、低成本的大片段DNA克隆与多基因叠加系统TGSII-UNiE（图1）。
图1 TGSII载体系统.（a）UNiE克隆盒的序列特征；（b）含UNiE克隆盒的pCAMBIA骨架的双元载体；（c）含UNiE克隆盒的TAC骨架的双元接受载体；（d和e）含UNiE克隆盒的多基因供给载体
对不同长度的DNA大片段（10.3 kb、14.8 kb和22.9 kb）的克隆测试结果表明，UNiEDA能高效的克隆不同长度的DNA大片段，且其克隆效率与采用试剂盒的Gibson组装方法相似，价格更低。载体与DNA大片段的摩尔比为1:3时，UNiEDA的效率最高；对于相同的DNA大片段，双元接受载体pYLTAC380H-UNiE的克隆效率高于pYL1300H-UNiE。对4个2.5 kb左右的DNA片段组装效率测试也表明，UNiEDA与Gibson组装方法具有相似的多DNA片段组装效率，且更经济。进一步，选用便于观察的红色甜菜红素与绿色荧光作为易检测的可视化marker，用UNiEDA直接在双元接受载体（pYL1300H-UNiE和pYLTAC380H-UNiE）上成功组装了含5个基因（均采用P35s启动子与Tnos终止子表达盒）的多基因载体（包括合成甜菜红素的四个基因BvCYP76AD1S, BvDODA1S, cDOPA5GT 和 ADH与一个绿色荧光蛋白基因eGFP）pYL1300H-CDGAeG和pYLTAC380H-CDGAeG，利用农杆菌介导的遗传转化，在本氏烟草叶片瞬时表达，以及稳定的***水稻愈伤与植株中，均能观察到甜菜红素的合成与绿色荧光，证明了UNiEDA能有效的组装含重复序列的多个DNA片段，构建的多基因载体是有功能的（图2）。对于少数基因（1-5个，或总长在12-15 kb以内）的组装，不需要重组反应，可直接利用UNiEDA在双元载体或双元接受载体上完成多基因组装。此外，利用上述结构，该研究探讨了相同启动子重复使用的问题，发现当重复使用P35S启动子超过5次时（结构pYL1300H-CDGeG和pYL1300H-CDGAeG），甜菜红素在多数***水稻愈伤组织和植株中不能正常合成，表明可能发生了同源启动子引起的***表达沉默，以及同源重组删除导致的***结构的不稳定性。因此相同启动子重复使用时，建议最多不超过4次。
图2 甜菜红素在***水稻中的合成。（a）四个多基因载体（pYL1300H-eG, pYL1300H-CDeG, pYL1300H-CDGeG and pYL1300H-CDGAeG）获得的***水稻愈伤表型；（b）pYL1300H-CDGAeG获得***水稻植株表型：Red ~ red表示从红色愈伤组织分化获得的红色转化植株；Green ~ red表示从红色愈伤组织分化获得的绿色转化植株（无甜菜红素合成）；Green ~ pale-yellow表示从淡黄色愈伤组织分化获得的绿色植株（无甜菜红素合成）；（c-g）***水稻植株外源基因的qRT-PCR分析
为测试更多基因的组装能力，该研究在合成甜菜红素的基础上，进一步在多基因供给载体上分别组装了与抗病相关的单子叶植物特有的脂肪族酚胺-羟基肉桂酰腐胺(HP)基因簇的3个基因（OsODC, OsPHT3 和OsPHT4），以及与氮代谢利用相关的3个谷氨酰胺合成酶基因（OsGS1;1, OsGS1;2 和 OsGS1;3），通过2轮简单的Cre/loxP重组，构建完成了含有12个基因（包括HPT筛选标记基因）T-DNA区约40 kb的多基因双元载体pYLTAC380H-GSs/HPs/CDGAeG（图3）。上述结果表明，在组装更多基因时，TGSII-UNiE系统更具有优势：利用UNiEDA在双元接受载体与多基因供给载体上，可同时平行进行多基因组装，最后只需1-2轮的Cre/loxP重组，就能完成更多基因与合成途径的组装。
图3 TGSII-UNiE系统对多基因的高效组装。（a）利用UNiEDA方法分别在多基因供给载体上一步组装HP基因簇的3个基因（OsODC, OsPHT3 和OsPHT4）与谷氨酰胺合成酶的3个基因（OsGS1;1, OsGS1;2 和 OsGS1;3），再通过两轮简单的Cre/loxP重组，组装上述多个基因到含5个基因的双元接受载体，获得含12个基因的多基因双元载体pYLTAC380H-GSs/HPs/CDGAeG；（b）多基因供给载体的酶切检测；（c）多基因双元载体的酶切检测与在农杆菌中的稳定性检测
综上， 该研究开发的TGSII-UNiE 系统，具有设计简单、操作方便、高效、省时、成本低等优点，可有效克隆长 DNA 片段并快速组装多个基因，在合成生物学与代谢工程等研究领域显示出巨大的应用前景。刘耀光院士团队祝钦泷研究员课题组长期致力于植物合成生物学、基因编辑和基因工程共性技术的开发与应用研究，已在Plant Biotechnology Journal发表了多研究论文，如开发了高效广靶向植物腺嘌呤碱基编辑系统PhieABEs（DOI: 10.1111/pbi.13774）、高效的模块化荧光融合蛋白工具箱AioFFP（DOI: 10.1111/pbi.13790）和高效的多基因叠加新系统TGSII-UNiE（DOI: 10.1111/pbi.13882），为植物功能基因组学、合成生物学、代谢工程和作物遗传改良等方面的研究提供能了实用工具与强有力的技术支撑。
生命科学学院博士生赵延昌，博士后韩靖鸾和谭健韬，硕士生杨雅茜为论文的共同第一作者，祝钦泷研究员与刘耀光院士为论文的共同通讯作者。该研究得到了岭南现代农业科学与技术广东省实验室项目、广东省基础与应用基础研究重大项目、国家自然科学基金和广东特支计划科技创新青年拔尖人才专项的资助。
文图/生命科学学院
